由于在紐約自然歷史博物館擔任警衛有出色表現，拉瑞（本·斯蒂勒 Ben Stiller 飾）出任某家電小公司的CEO，而且還在電視上接受了著名脫口秀主持人的訪談，兒子對他仰慕，愛情如影隨形，一派春風得意的樣子。不過，好景不長，當他故地重游，卻意外發現館長已經因為更新展覽并準備把過時的展品挪到華盛頓的史密森博物館繼續展出。這讓拉瑞感到有些氣憤，他覺得自己有責任重振博物館之雄風，于是他決定留下來再做一晚警衛，以喚起那些老朋友的共同努力。事實上，在搞定了羅斯福（羅賓·威廉斯 Robin Williams 飾）、林肯、拿破侖、伊凡雷帝和阿爾?卡邦等人之后，他遭遇了一個勁敵——邪惡的古埃及法老的卡門拉，二人在夜晚再度上演了博物館的驚魂對決……
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